نقش پروتئینها و پپتیدها در میکروکپسولهای روغن ماهی از حیث پایداری فیزیکی را می توان با نقش آنها در پایداری امولسیون اولیه به دلیل دارا بودن فعالیت سطحی و همچنین به عنوان ماده دیواره ای در ارتباط دانست. پروتئینهای استخراج شده از منابع متنوع طبیعی، مانند سویا، آب پنیر، کازئین، ماهی، گوشت و پروتئینهای گیاهی،
می توانند به دلیل توانایی شان در تسهیل تشکیل، بهبود پایداری و تولید ویژگی های فیزیکوشیمیایی مناسب در امولسیونهای روغن در آب (O/W)، به عنوان امولسیفایر در مواد غذائی مورد استفاده قرار گیرند (Dickinson, 2003; McClements, 2004). پروتئینها ترکیباتی دو خاصیتی  محسوب می شوند که قادرند با قرار گرفتن در حد فاصل دو فاز امتزاج ناپذیر، کشش سطحی را کاهش دهند و لایه ویسکوالاستیکی ایجاد نمایند که از بهم پیوستن قطرات جلوگیری می کند (Dickson, 1999 & 2006). در عین حال قابلیت پروتئینها و فراکسیونهای حاصل از آنها در تشکیل و پایداری امولسیونها متفاوت است و به ساختمان، آرایش فضایی، و حالت تجمعی  آنها بستگی دارد. بخوبی مشخص شده است مقدار پروتئین مورد نیاز برای پایدارسازی امولسیونهای O/W نه تنها به نوع پروتئین بینابینی و میانگین قطر قطرات روغن، بلکه به نوع روغن (به عنوان مثال شکل هیدروکربنی مانند n-تترادِکان و یا تری آسیل گلیسیرولی مانند روغن سویا) نیز بستگی دارد. پوشش کامل قطرات روغن اغلب مستلزم به کارگیری غلظت بحرانی (*C) پروتئین در فاز آبی است. گزارش شده است حضور کازئینات اضافی در امولسیون دارای غلظت بالای پروتئین (C*<C) سبب تحریک فلوکوله شدن قطرات روغن و تشکیل خامه، به دلیل تمایل شدید ساب میسلهای کازئین به تشکیل ذرات پروتئنی کوچک می گردد. در مقابل در امولسیونهای  حاوی غلظت پایین کازئینات (C*>C)، سطح روغن به طور کامل با پروتئین پوشیده نخواهد شد؛ بنابراین مولکولهای کازئین به طور مشترک میان قطرات روغن قرار گرفته، پلهای فلوکوله کننده تشکیل می دهند. بنابراین پایداری مطلوب امولسیون مستلزم پوشش کامل سطوح بینابینی روغن–آب بدون باقی گذاشتن مقدار قابل ملاحظه پروتئین جذب نشده است (C*=C) (Dickson, 1999).
یک امتیاز عمده بالقوه پروتئین ها به عنوان امولسیفایر در مواد غذایی، قابلیت آنها در محافظت از روغن های زنجیره بلند چندغیراشباع در برابر اکسیداسیون کاتالیز شده با آهن می باشد. پروتئینها در pHهای بالاتر از نقطه ایزوالکتریک شان (pI)، در اطراف قطرات روغن لایه بین سطحی با بار الکتریکی مثبت تشکیل می دهند که بطور الکترواستاتیک یونهای +Fe2 و Fe3+ موجود در فاز مایع را دفع می نمایند. بدین ترتیب از کاتالیز اکسیداسیون لیپیدهای چندغیراشباع موجود درون قطرات توسط آهن، ممانعت بعمل می آید. یکی از محدودیتهای اصلی استفاده از پروتئینهای غذایی برای این منظور اینست که اغلب آنها دارای pI بین 5/4 تا 5/5 بوده و بنابراین قطرات امولسیونی دارای بار الکتریکی مثبت (کاتیونیک) تنها می تواند در مقادیر pH پایین تولید گردد. در عین حال فاز آبی اکثر محصولات غذایی دارای pH بالاتر از 5 می باشد و بنابراین امولسیون های تهیه شده با اغلب امولسیفایرهای پروتئینی دارای قطرات با بار الکتریکی منفی (آنیونیک) بوده که به دلیل جذب کاتیونهای آهن به سطوح قطرات، مستعد اکسیداسیون لیپیدها می باشند (McClements & Decker, 2000).
ژلاتین یک مولکول پروتئینی با وزن مولکولی نسبتاً بالاست که از کولاژن حیواناتی مانند گاو، خوک و ماهی استحصال می گردد (Ledward, 1986). ژلاتین به وسیله هیدرولیز کولاژن با جوشاندن در حضور اسید (ژلاتین نوع A) و یا قلیا (ژلاتین نوع B) تهیه می شود. نقطه ایزوالکتریک ژلاتین نوع A (حدود 7 تا 9) در مقایسه با ژلاتین نوع B (حدود 5) بالاتر است. نقطه ایزوالکتریک نسبتاً بالاتر ژلاتین نوع A ((pI≥ 7.0 بدین معناست که، در مقایسه با امولسیفایرهای پروتئینی مرسوم مانند سویا، کازئین یا پروتئین آب پنیر، امکان ساخت امولسیون های O/W دارای بار الکتریکی مثبت را در دامنه وسیعتری از pH ممکن می سازد (Dickinson & Lopez, 2001). در نتیجه احتمالاً ژلاتین نوع A برای ساخت امولسیون های غذایی O/W با پایداری بالا در برابر اکسیداسیون مناسب است، زیرا قادر به دفع یونهای آهن از سطح قطرات در دامنه وسیعی از pHهای معمول مواد غذایی، می باشد. با اینحال پی بردن به این نکته که آیا ژلاتین می تواند برای تهیه امولسیونهایی که از لحاظ فیزیکی نیز پایدار باشند مورد استفاده قرار گیرد نیز بسیار حائز اهمیت است. برخی مطالعات نشان داده اند که ژلاتین دارای فعالیت سطحی بوده و می تواند به عنوان امولسیفایر در امولسیون های O/W عمل نماید. تجربیات نشان داده اند که استفاده از ژلاتین منجر به تولید قطرات نسبتاً درشت طی هموژنیزاسیون می گردد (Dickson & Lopez, 2001; Lobo, 2002)، تا حدی که بایستی از طریق پیوستن گروه های جانبی غیرقطبی از حیث آبگریزی اصلاح گردد (Toledano & Magdassi, 1998) یا بوسیله ترکیب با سورفاکتانتهای آنیونیک اثربخشی آن به عنوان امولسیفایر بهبود یابد (Muller & Hermel, 1994; Olijve, Mori & Toda, 2001; Surh, Gu, Decker & McClements, 2005).
Surh، Decker و McClements (2006) تاثیر اوزان مولکولی بر قابلیت ژلاتین ماهی (FG) در تشکیل و پایداری امولسیونهای O/W را مورد بررسی قرار دادند. ژلاتینهای ماهی با وزن مولکولی پایین (LMW-FG, ~55 kDa) و با وزن مولکولی بالا (HMW-FG, 120 kDa) جهت تهیه امولسیون %wt  20 روغن ذرت– در– آب (pH 3.0, 10 mM imidazole- acetate buffer) مورد استفاده قرار گرفت. امولسیونهای با توزیع اندازه ذرات تک مُدلی و میانگین قطر قطره های کوچک (d43≈ 0.35 μm برای LMW-FG و μm 0.71 برای HMW-FG) می تواند در غلظت های پروتئینی  ≥ 0/4 wt% تولید گردد. در عین حال مشاهدات با میکروسکوپ نوری نشان داد که همواره جمعیت کوچکی از قطرات بزرگ پس از هموژنیزاسیون، در امولسیونها وجود داشته و موجب کاهش  پایداری روغن (≥ 2 wt%) می گردند. حضور این قطرات درشت به فعالیت سطحی نسبتاً پائین (C1/2=0.1-0.2 wt%) ژلاتین ماهی در مقایسه با پروتئین های کروی مانند بتا-لاکتوگلوبولین (C1/2= 0.004 wt%) نسبت داده شده است. امولسیونهای پایدار شده با LMW-FG در مقایسه با امولسیون های HMW-FG دارای جمعیت بزرگتری از قطرات درشت بودند، اما در برابر تشکیل خامه (creaming) بسیار پایدارتر بودند که می توان به کاهش فلوکولاسیون نسبت داد. امولسیون های پایدار شده با ژلاتین ماهی پس از قرار گرفتن در معرض تغییرات دمای نگهداری (30 یا 90 درجه سلسیوس برای 30 دقیقه)، غلظت نمک (NaCl ≤ 250 mM) و pH  ( 3 تا 8) در برابر بهم پیوستن (aggregation) و تشکیل خامه نسبتاً پایدار باقی ماندند. در این تحقیق ادعا شده که احتمالاً ژلاتین ماهی کاربرد محدودی به عنوان امولسیفایر پروتئینی در امولسیون های O/W دارد.
پروتئین های خوراکی منبع پپتیدهایی هستند که از حیث بیولوژیک فعال بوده ولی درون توالی پروتئین مادری غیرفعال شده اما می توانند طی هضم و یا فرآیند ماده غذایی آزاد گردند. هنگامی که پپتیدهای زیست فعال آزاد گردند ممکن است به عنوان ترکیبات تنظیم کننده با فعالیت شبه هورمونی و یا سایر عملکردها مانند آنتی اکسیدانی، ضدباکتریایی و ... عمل نمایند (Tahergorabi و همکاران، 2012).
از زمانیکه اولین گزارش در زمینه اثرات آنتی اکسیدانی پپتیدها منتشر گردید (Marcus, 1960)، تحقیقات متعددی خواص آنتی اکسیدانی پروتئینهای هیدرولیز شده و پپتیدها را از هر دو منبع گیاهی و جانوری، نظیر سبوس برنج (Revilla و همکاران، 2009)، پروتئین آفتابگردان (Megias و همکاران، 2008)،  پروتئین برگ آلفالفا (Xie و همکاران 2008)،  کازئین (Suetsuna، Ukedaو Ochi، 2000)، پروتئین سفیده تخم مرغ (Sakanaka و Tachibana، 2006)، پروتئین عضله ماکرل (Wu و همکاران، 2003)، ژلاتین پوست اسکوئید (Mendis،  Rajapakse و Kim، 2005)،  ژلاتین پوست ماهی (Mendis،  Rajapakse و Kim، 2005)، ژلاتین پوست دام (Kim و همکاران، 2001)، ستون فقرات ماهی تون (Je و همکاران، 2007)، آب پخت تون ماهیان (Hsu، Lu و Jao، 2009) و غیره، مورد مطالعه قرار داده اند (Gómez- Guillén،  Giménez- Caballero و Montero، 2011).
مکانیسم اصلی فعالیت آنتی اکسیدانی پپتیدها به درستی شناخته نشده است ولی مطالعات متعددی نشان داده اند که از اکسیداسیون اولیه لیپیدها جلوگیری نموده، زداینده رادیکال های آزاد و گیرنده یون های فلزات واسطه
می باشند. بر اساس برخی مطالعات، پپتیدهای ژلاتین قادرند در مقایسه با پپتیدهای مشتق شده از اغلب منابع پروتئینی دیگر بطور مؤثرتری از اکسیداسیون اولیه لیپیدها جلوگیری نمایند (Kim و همکاران 2001).
ادعا شده است که خواص ضداکسایشی پپتیدها وابسته به ترکیب اسیدهای آمینه، ساختمان و میزان آبگریزی آنها می باشد. ترکیب اسیدهای آمینه کولاژن و ژلاتین هیدرولیز شده بسیار مشابه پروتئینهای مادری بوده و غنی از باقیمانده های Gly، Ala، Pro، Hyp، Glx و Asx، ولی فقیر از حیث Met، Cys، His و Tyr می باشد (Alemán، Giménez، Pérez-Santín و همکاران، 2011؛ Gómez- Guillén و همکاران، 2010؛ Kim و همکاران، 2001؛Mendis  و همکاران، 2005).
Dávalos، و همکاران (2004) فعالیت اختصاصی آمینواسیدها را مورد مطالعه قرار داده و گزارش نموده اند که Trp، Tyr و Met ، و پس از آنها Cys، His و Phe بالاترین فعالیت آنتی اکسیدانی را نشان دادند. مجموعه آمینواسیدها هیچ فعالیت ضداکسایشی را نشان نداد. در عین حال بیان شده است که بسیاری از پپتیدهای فاقد هریک از باقیمانده های پروتون دهنده آمینواسیدهای فوق الذکر در زنجیره شان، دارای ظرفیت ضداکسایشی می باشند.
Kim و همکاران (2001) دو پپتید متشکل از باقیمانده های 13 و 16 آمینواسید را از پوست آلاسکا پولاک جدا نمودند که هر دوی آنها دارای باقیمانده Gly در انتهای -C و واحدهای تکرار شونده Gly-Pro-Hyp بودند.
Li و همکاران (2007) پپتیدی که بالاترین فعالیت آنتی اکسیدانی را در کولاژن هیدرولیز شده پوست خوک نشان داد با توالی Gln- Gly-Ala- Arg تعیین نمودند. پپتید Asn-Gly-Pro-Leu-Gln-Ala-Gly-Gln-Pro-Gly-Glu-Arg با ظرفیت قابل ملاحظه کاهش اثرات رادیکالهای آزاد، از ژلاتین پوست اسکوئید تخلیص گردید (Mendis و همکاران، 2005). به علاوه فعالیت آنتی اکسیدانی پپتیدهای کولاژن و ژلاتین با بالا بودن مقدار آمینواسیدهای آبگریز پیوند خورده است که می تواند حلالیت در روغن را افزایش داده و بنابراین فعالیت آنتی اکسیدانی آنها را افزایش دهد (Kim و همکاران، 2001).
Mendis و همکاران (2005) دریافتند که پپتیدهای ژلاتین ماهی در مقایسه با پپتیدهای بدست آمده از پروتئین گوشت، احتمالاً به دلیل درصد بالاتر Gly و Pro، فعالیت آنتی اکسیدانی بیشتری دارند.
نه تنها حضور اسیدهای آمینه مشخصی ضروری است، بلکه موقعیت صحیح شان در توالی زنجیره پپتید نیز نقش مهمی را در فعالیت آنتی اکسیدانی ایفا می نماید. حین ملاحظه فعالیت آنتی اکسیدانی اسیدهای آمینه آزاد، ادعا شده است که ساختمان فضایی پپتید نیز بر ظرفیت ضداکسایش، به هر دو صورت سینرژیستی و آنتاگونیستی، تاثیر دارد (Hernández-Ledesma و همکاران، 2005).
اختصاصی بودن پروتئازهای مورد استفاده برای هیدرولیز می تواند تعیین کننده اندازه و توالی پپتیدها و در نتیجه فعالیت آنتی اکسیدانی آنها باشد. تعدادی زیادی پروتئازهای تجاری، شامل تریپسین، کیموتریپسین، پپسین، پروپرآز E ((Properase E، پروناز، کولاژناز، بروملین و پاپائین، برای تولید آنتی اکسیدانهای هیدرولیزی از ژلاتین استفاده شده اند. مشخص شده که آلکالاز، یک پروتئاز تجاری با منشاء میکروبی، کارآمدترین آنزیم در هیدرولیز پروتئین ماهی است ((Guérard, Dufossé, De La Broise, & Binet, 2000. گزارش شده که این آنزیم فعالیت هیدرولیزی بالایی را در ژلاتین حاصل از پوست آلاسکاپولاک (Kim و همکاران، 2000)، اسکوئید (Nam و همکاران، 2008) و اسکوئید غول پیکر (Giménez و همکاران، 2009) تولید می نماید.
 میانگین وزن مولکولی محصول هیدرولیز پروتئینها یکی از مهمترین عوامل تعیین کننده خواص بیولوژیک آنها می باشد (Jeon و همکاران، 1999؛ Park و همکاران، 2001). فراکسیونهای پپتیدی حاصل از هیدرولیز پروتئینها می تواند از لحاظ کارآمدی برای یک فعالیت بیولوژیک خاص متفاوت عمل نمایند. فراکسیون حاصل از هیدرولیز پوست کوبیا، با جرم مولکولی عمدتاً پائین تر از Da 700، بالاترین فعالیت زدودن رادیکال ها، تقریباً 20٪ بیش از  محصولات هیدرولیز شده غیرفراکسیونه، را نشان داد (Yang، Ho و همکاران، 2008؛ Yang، Wong و همکاران، 2008).
Gómez-Guillén و همکاران (2010) ژلاتین استخراج شده از پوست ماهی تون و نیام های داخلی و بیرونی اسکوئید غول پیکر را توسط آنزیم آلکالاز، در دمای ºC 50 به مدت 3 ساعت، هیدرولیز و دو فراکسیون پپتیدی با اوزان مولکولی≤ 1 kDa و 1-10 kDa را با روش اولترافیلتراسیون سانتریفوژی جداسازی نموده و خاصیت
آنتی اکسیدانی و آنتی میکروبی آنها را مورد بررسی قرار دادند. این محققین گزارش نموده اند که با وجود مشاهده خواص آنتی اکسیدانی و آنتی میکروبی در تمامی فراکسیونهای پپتیدی مورد بررسی، فراکسیون پپتیدی حاصل از هیدرولیز زائدات اسکوئید دارای کمترین وزن مولکولی، بالاترین ظرفیت احیاکنندگی و به دام انداختن رادیکالها را از خود نشان داده است. در حالیکه بازدارندگی رشد میکروبها به طور اختصاصی و وابسته به نوع میکروارگانیسم گزارش شده است. آنان همچنین ادعا نموده اند که مستقل از ترکیب اولیه آمینو اسیدهای ژلاتین، نسبت اسیدهای آمینه آبگریز به آبدوست می تواند براساس اندازه مولکولی پپتیدهای غالب در فراکسیونهای پپتیدی تغییر نماید که البته این تغییرات در گونه های تون و اسکوئید به دلیل تفاوت در نوع و اندازه پپتیدهای اولیه متفاوت بدست آمده است. علی رغم اینکه باقیمانده اسیدهای آمینه هیدروفوبیک در فراکسیون های پپتیدی ژلاتین اسکوئید کمتر بوده، فعالیت آنتی اکسیدانی فوق العاده قویتری نشان داده است. این امر احتمالاً به بالاتر بودن حضور توالیهای فعال خاص در هیدرولیز ژلاتین اسکوئید نسبت داده شده که می تواند در ارتباط با حضور باقیمانده های Leu و Ile در -C و -N انتهایی باشد که در اثر هیدرولیز آلکاز تولید گردیده اند.
منابع:
1. Bae, E. K., & Lee, S. J. (2008). Microencapsulation of avocado oil by spray drying using whey protein and maltodextrin. Journal of Microencapsulation, 1–12.
2. Bule, M.V., Singhal, R.S., & Kennedy, J.F. (2010). Microencapsulation of ubiquinone-10 in carbohydrate matrices for improves stability. Carbohydrate Polymers 82 (1): 1290–1296.
3. Carneiro, C.F.G.; Tonon, R.V.; Grosso, C.R.F., & Hubinger, M.D. (2012). Encapsulation efficiency and oxidative stability of flaxseed oil microencapsulated by spray drying using different combinations of wall materials; Journal of Food Engineering,
4. Day, L., Xu, M., Hoobin, P., Burgar, I., & Agustin, M.A. (2007). Characterization of fish oil emulsions stabilized by sodium caseinate; Food Chemistry, 105: 469-479.
5. Dickinson, E. (1999). Caseins in emulsions: Interfacial properties and interactions. International Dairy Journal, 9: 305–312.
6. Dickinson, E. (2006). Structure formation in casein-based gels, foams and emulsions. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 288, 3–11.
7. Gómez- Guillén, M.C.; Giménez-Caballero, M.E. & Montero, M.P. (2011). Functional and bioactive properties of collagen and gelatin from alternative resources: A review; Food Hydrocolloid, 25: 1813-1827.
8. Gómez-Guillén MC., López-Caballero ME., Alemán A., López de Lacey A., Giménez, B. & Montero, P. (2010). Antioxidant and antimicrobial peptide fractions from squid and tuna skin gelatin; In: Sea By-Products as Real Material: New Ways of Application, Section 7: 89-115, Estelle Le Bihan (Edit.). Transworld Research Network, Kerala, India.
9. Guérard, F.; Dufossé, L.; De La Broise, D. & Binet, A. (2001). Enzymatic hydrolysis of proteins from yellowfin tuna (Thunnus albacares) wastes using Alcalase. Journal of Molecular Catalysis - B Enzymatic, 11(4-6): 1051-1059.
10. Hogan, S.A., Mcnamee, B.F., O’Riordan, E.D., & O’Sullivan, M. (2001). Emulsification and microencapsulation properties of sodium caseinate/carbohydrate blends. International Dairy Journal, 11 (3), 137–144.
11. Hogan, S.A., O’Riordan, E.D., & O’Sullivan, M. (2003). Microencapsulation and oxidative stability of spray-dried fish oil emulsions. Journal of Microencapsulation 20(5): 675–688.
12. Jafari, S.M., Assadpoor, E., He, Y. & Bhandari, B. (2008). Encapsulation efficiency of food flavours and oils during spray drying. Drying Technology, 26 (7): 816–835.
13. Klaypradit, W. & Huang, Y.W. (2008). Fish oil encapsulation with chitosan using ultrasonic atomizer. LWT, 41: 1133-1139.
14. Kim, S.; Kim, Y.; Byun, H.; Nam, K.; Joo, D. & Shahidi, F. (2001). Isolation and characterization of antioxidative peptides from gelatin hydrolysate of Alaska Pollack skin. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49(4): 1984-1989.
15. Kolanowski, W.; Ziolkowski, M.; Weißbrodt, J.; Krunz, B. & Laufenberg, G. (2006). Microencapsulation of fish oil by spray drying-impact on oxidative stability. Part 1. European Food Research and Technology, 22(2): 336-42.
16. Kuhn, K.R. & Cunha, R.L. (2012). Flaxseed oil – Whey protein isolate emulsions: Effect of high pressure homogenization. Journal of Food Engineering, 111: 449-457.
17. Lowry, O.H.; Rosenbrough, N.J.; Farolir, A.L. and Randall, R.J. (1951). Protein measurement with the folin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry, 193: 265-275.
18. McClements D.J., Decker E.A., Park Y., Weiss J. (2009) Structural design principles for delivery of bioactive components in nutraceuticals and functional foods. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 49:577-606. DOI: 10.1080/10408390902841529.
19. Surh, J.; Decker, E. A. and McClements, D. J. (2006). Properties and stability of oil-in-water emulsions stabilized by fish gelatin; Food Hydrocolloids, 20: 596–606.
20. Tahergorabi, R.; Beamer, S.K.; Matak, K.E. and Jaczynski, J. (2012). Functional food products made from fish protein isolate recovered with isoelectric solubilization/ precipitation; LWT - Food Science and Technology, 48: 89-95.
21. Taherian, A.R.; Britten, M.; Sabik, H., & Fustier. P. (2011). Ability of whey protein isolate and/or fish gelatin to inhibit physical separation and lipid oxidation in fish oil-in-water beverage emulsion. Food Hydrocolloids, 25: 868-878.
22. Wang, R.; Tian, Z. and Chen, L. (2011). A novel process for microencapsulation of fish oil with barley protein; Food Research International, 44: 2735-2741.
23. Wang, H.; Liu, F.; Yang, L.; Zu, Y.; Wang, H.; Qu, S. and Zhang, Y. (2011). Oxidative stability of fish oil supplemented with carnosic acid compared with synthetic antioxidants during long-term storage. Food Chemistry, 128: 93-99.
24. Yang, J.; Ho, H.; Chu, Y. & Chow, C. (2008). Characteristic and antioxidant activity of retorted gelatin hydrolysates from cobia (Rachycentron canadum) skin. Food Chemistry, 110(1): 128-136.
25. Zhang, Y., Yang, L., Zu, Y. G., Chen, X. Q., Wang, F. J., & Liu, F. (2010). Oxidative stability of sunflower oil by carnosic acid compared with synthetic antioxidants during accelerated storage. Food Chemistry, 118: 656–662.